理化学研究所、真菌類などが持つ３重らせん型βグルカンを認識する仕組みを解明

真菌類などが持つ３重らせん型βグルカンを認識する仕組みを解明
−生体防御システムにおける３重らせん構造認識の秘密が明らかに−



◇ポイント◇
　・３重らせん型βグルカンに結合したタンパク質の立体構造を解析
　・自然免疫における異物認識の仕組みが原子レベルで明らかに
　・免疫調整剤の設計や真菌感染症の診断・モニタリングへの応用が可能に


　独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８（※１）及び高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）放射光科学研究施設フォトンファクトリー（※２）を利用して、βグルカン（※３）とパターン認識受容体（※４）の１つである「βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３（※５）」とが結合した複合体の立体構造をＸ線結晶構造解析で解明し、非自己成分と特異的に結合するパターン認識受容体が、生体防御システムにおいて異物となるβグルカンの３重らせん構造を特異的に認識する仕組みを世界で初めて明らかにしました。これは、理研基幹研究所（玉尾皓平所長）糖鎖構造生物学研究チームの山口芳樹チームリーダー、金川真由美研究員、佐藤匡史研究員（現、名古屋市立大学・薬学部准教授）らと東京薬科大学の大野尚仁教授、安達禎之准教授らとの共同研究による成果です。

　グルカンはグルコースが直鎖上に連結した重合体（ポリマー）で、天然に最も多く存在する多糖です。β結合でつながったβグルカンは真菌類や植物の細胞壁などに多く存在しますが、ヒトなどの哺乳類には存在しません。生体防御システムの１つである自然免疫（※６）では、パターン認識受容体が、βグルカンなどの異物を認識することから免疫応答が働き始めます。βグルカンは、Ｘ線回折や固体ＮＭＲなどの解析により３重らせん構造を形成していることが示されてきましたが、パターン認識受容体がこの構造を特異的に認識する仕組みは明らかとなっていませんでした。

　研究グループは、３重らせん構造を形成しているβグルカンと特異的に結合するパターン認識受容体「βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３」に着目し、βグルカンとの複合体の立体構造を解析しました。その結果、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３は多数のアミノ酸残基からなる幅広い結合面を利用してβグルカンの３本鎖を全て認識する、という極めてユニークな仕組みを備えていることが分かりました。

　今回明らかとなった３重らせん構造認識の仕組みは、βグルカンの免疫調整剤としての機能を高める合理的薬剤設計など薬学分野へ貢献するだけでなく、血中や体液中のβグルカンを検出するためのツールの開発に役立ち、真菌感染症の診断やモニタリングへの応用など医療分野への貢献も期待されます。

　本研究成果は、米国の科学雑誌『Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』（オンライン版６月２２日）に掲載されました。


１．背景
　セルロース、アミロース、βグルカンなどの多糖は、構成糖の結合様式や水素結合のパターンなどによってさまざまな構造をとることが知られています。酵母などの真菌類や植物の細胞壁の構成成分として知られるβグルカンは、Ｘ線回折や固体１３Ｃ−ＮＭＲなどの物理化学的手法により３重らせん構造を形成していることが示されてきました。これまでに、１本のβグルカン鎖が残りの２本のβグルカン鎖と水素結合を形成しているモデルが報告されています。

　生体防御システムでは、βグルカンは非自己成分としてパターン認識受容体に認識されます。これまでの研究から、βグルカンに結合するパターン認識受容体の多くは、３重らせん構造を形成しているβグルカンとだけ結合することが知られていました。パターン認識受容体の１つであるβＧＲＰ／ＧＮＢＰ３も、３重らせん構造を形成しているβグルカンとは結合しますが、１本鎖のβグルカンとはほとんど結合しないことが知られています。しかし、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３をはじめとするパターン認識受容体が、βグルカンの３重らせん構造を特異的に認識する仕組みは明らかになっていませんでした。

　今回研究グループは、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３のβグルカン結合ドメイン（※７）とβグルカンとの複合体の立体構造を解析し、βグルカンの３重らせん構造を特異的に認識する仕組みの解明に挑みました。


２．研究手法と成果
　Ｘ線結晶構造解析を行うため、カイコ及びノシメマダラメイガのβＧＲＰ／ＧＮＢＰ３のβグルカン結合ドメインを大腸菌で大量に発現させ、このタンパク質を用いてさまざまな種類や長さのβグルカン鎖との複合体の結晶化スクリーニング（※８）（約２，６００条件）を行いました。その結果、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３のβグルカン結合ドメインと６つのグルコースからなるβグルカン鎖との複合体を結晶化することに成功しました。

　この結晶化に成功した複合体について、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ２６Ｂ２にて良質なＸ線回折データを与える結晶のスクリーニングを迅速に行い、高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）フォトンファクトリーのビームラインＢＬ５Ａ、ＮＷ１２−Ａ及びＮＥ−３Ａで最終的なＸ線回折データの収集を行いました。これらの実験により、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３のβグルカン結合ドメインとβグルカン鎖の複合体の立体構造を解明しました（図１）。βグルカン鎖との相互作用に関与しているβＧＲＰ／ＧＮＢＰ３上のアミノ酸残基は、立体構造上広範囲に分布していることが分かりました。また、結晶中の複合体では、βグルカン鎖は３重らせん様の構造を形成し、これまで報告されてきたモデルをほぼ忠実に反映していました（図２）。

　結晶中で見られたβＧＲＰ／ＧＮＢＰ３とβグルカン鎖の相互作用が水溶液中でも起きていることを確認するため、βグルカン鎖と直接相互作用しているβＧＲＰ／ＧＮＢＰ３上のアミノ酸残基（Ｈ３１，Ｌ４１，Ｒ４８，Ｄ４９，Ｗ７６，Ｙ７８，Ｒ８７）のそれぞれについて変異体を作製しました。これらの変異体を用いてβグルカン鎖との結合実験を行った結果、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３の変異体の大部分は、βグルカン鎖との結合能を失っていることが分かりました。この結果は、これら広範囲に分布するアミノ酸残基が水溶液中でもβグルカン鎖と相互作用することを示すとともに、いずれのアミノ酸残基もβグルカンの認識に重要であることを示しています。また、Ｄ４９のように同時に１本以上のβグルカン鎖と相互作用しているアミノ酸残基の存在も明らかとなり、βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３が多数のアミノ酸残基を利用してβグルカンの３本鎖全てを認識する、という極めてユニークな仕組みを備えていることを突き止めました（図３）。

　これらの結果から、パターン認識受容体が多数のアミノ酸残基からなる幅広い結合面を利用してβグルカンの３本鎖を認識することによって、βグルカンの３重らせん構造を特異的に認識する仕組みが世界で初めて明らかになりました。


３．今後の期待
　βグルカンなどの多糖は、免疫調節剤として機能することが報告されています。また、βグルカンの抗がん作用や抗感染作用は、βグルカンの立体構造に依存することが知られています。今回の成果で明らかとなった３重らせん構造認識の仕組みを基に、分岐糖鎖の導入や修飾によりβグルカンの合理的な薬剤設計が実現します。また、こうした薬学分野への貢献だけでなく、この仕組みを活用して血中や体液中のβグルカンを検出するツールを開発することで、アスペルギルス症（※９）などの真菌感染症の診断やモニタリングへの応用にもつながると期待されます。



＊以下の資料は添付の関連資料「補足説明／図１〜３」を参照
　・補足説明
　・図１　βＧＲＰ／ＧＮＢＰ３が３本鎖βグルカンを認識する様子
　・図２　３重鎖βグルカン鎖に見られる水素結合パターンの様子
　・図３　広範囲にわたる多くのアミノ酸残基によって３重鎖βグルカンを認識する