東大と明大など、すい臓のないブタに健常ブタ由来のすい臓を再生することに成功

すい臓のないブタに健常ブタ由来のすい臓を再生することに成功


＜ポイント＞
　＞臓器を欠損している動物に異なる動物由来の臓器を作らせることは、小型実験動物では成功しているが、大型動物ではできるのかがこれまでの課題。
　＞体細胞クローニング技術を用いて、すい臓欠損クローンブタを作製、胚盤胞補完技術を用いて、正常ブタ由来のすい臓を持つキメラブタの作製に成功。
　＞将来の再生医療にも大きく期待。


　JST　課題達成型基礎研究の一環として、東京大学　医科学研究所の中内　啓光　教授とJST　戦略的創造研究推進事業　ERATO型研究「中内幹細胞制御プロジェクト」の松成　ひとみ　研究員、同プロジェクトチームの明治大学　農学部　生命科学科の長嶋　比呂志　教授らは、遺伝子導入と体細胞クローニング（注１）技術を用いて、すい臓のないクローンブタを作ることに成功しました。さらに、このすい臓のないクローンブタに体細胞クローニング技術と胚盤胞補完技術を用いて、健常ブタの胚細胞由来のすい臓を作ることに成功しました。
　研究チームはこれまで、臓器を欠損している動物に、ほかの動物の臓器を作らせることをマウスとラットの小型動物では成功しており、大型動物でも同じことができるかが次の課題でした。今回、体細胞クローニング技術によりすい臓を持たないクローンブタを作り、その胚（ホスト胚）に正常ブタ由来の胚（ドナー胚）を注入し、胚盤胞補完法（注２）によって、キメラ（注３）胚盤胞からすい臓欠損の遺伝子を持ち正常ブタ由来のすい臓を再生させたキメラブタを作ることに成功しました。
　ブタのような大型動物においても、胚盤胞補完法による臓器再生の原理が証明されたことから、本研究成果を応用すればヒトの臓器がどのように形成されるのか、そのメカニズムを異種動物の体内で解析することが可能になります。さらに大型動物の体内でヒトの臓器を再生するといった、全く新しい再生医療技術の開発に大きく貢献するものと期待されます。
　本研究は東京大学、明治大学と共同で行われ、本研究成果は、米国科学雑誌「米国科学アカデミー紀要（PNAS）」のオンライン速報版で２０１３年２月１８日の週（米国東部時間）に公開されます。


　本成果は、以下の事業・研究プロジェクトによって得られました。
　　戦略的創造研究推進事業　ERATO型研究
　　　研究プロジェクト：「中内幹細胞制御プロジェクト」
　　　研究総括：中内　啓光（東京大学　医科学研究所　教授）
　　　研究期間：平成１９〜２４年度
　JSTはこのプロジェクトで、臓器発生過程の基礎的研究と、その知見に基づいた臓器再生法確立のための新技術の研究を行っています。


＜研究の背景と経緯＞
　多能性幹細胞（注４）である胚性幹細胞（ES細胞）（注５）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）（注６）から臓器を作り出すことは、再生医療の究極目標の１つです。しかし臓器を作るためには、その立体的な構造を生体外で再現しなければならず、困難を極めます。そこで本研究では「胚盤胞補完法（Blastocyst　complementation）」の技術に注目しました。
　胚盤胞補完法とは、特定の細胞を作る能力を欠損しているマウスの胚盤胞に正常なマウス由来の多能性幹細胞を注入し、キメラが成立すると、欠損した細胞が完全に多能性幹細胞由来のものに置き換えられるというもので、今から１５年ほど前にリンパ球を欠損したマウスを用いてその原理が報告されています。その後、研究チームはこの原理を応用し、遺伝的にすい臓を欠損するマウスの胚盤胞に、ラットの多能性幹細胞を注入することによって、マウスの生体内でラットのすい臓を作ることに成功しました（Cell．２０１０）。
　また、腎臓を欠損するマウスの胚盤胞に同種の多能性幹細胞を注入することで、欠損していた腎臓を外来性幹細胞から作り出すことにも成功しました。この成果によって、すい臓や腎臓のような固形臓器の生産にも胚盤胞補完法は応用が可能であること、さらにマウス、ラットという異種動物間にも胚盤胞補完原理が適用できることが示されました。
　胚盤胞補完法によってヒト臓器の作製を目指すためには、マウスやラットという小型動物ではなく、ヒトの体格に近い大型動物を用いてサイズの大きな臓器を作ることが必要です。そこで、ヒトに類似した特徴を持つブタを用いて、大型動物を用いた胚盤胞補完法を行うための技術的基盤の構築を目指して本研究を行いました（図１）。


＜研究の内容＞
（１）すい臓欠損ブタの作出（図２）
　本研究ではまず、すい臓を持たないブタを作り出すことに取り組みました。マウスの実験では、Pdx１遺伝子の破壊という方法を選択しましたが、ブタでは遺伝子破壊に時間がかかるために、Pdx１−Hes１遺伝子（注７）の過剰発現によってすい臓形成を阻害するという方法を採用しました。Pdx１−Hes１遺伝子を顕微授精法（注８）でブタ卵に注入することによって、すい臓のないブタを作りました。大型動物で初めて、臓器のない個体を作り出すことを実現したものです。

（２）胚盤胞補完法を用いてすい臓欠損ブタの体内に健常ブタ由来のすい臓を作る（図３）
　すい臓のないブタは、生後まもなく重度の高血糖症状などによって死亡するため、成長後に繁殖させ、胚（受精卵）を採取することは不可能です。そこで、すい臓のないブタの細胞から、体細胞クローニング技術によってクローン胚（ホスト胚）を作り、ホスト胚に健常なブタから作り出したクローン胚の細胞（ドナー胚）を注入するという胚盤胞補完を行いました（図１）。そのとき、健常なブタとして、赤色蛍光たんぱく（humanized　Kusabira−Orange）遺伝子を持つブタと褐色の毛色を持つブタを用いることで、胚盤胞補完によって得られるキメラ個体が、蛍光発現と毛色によって識別できるように工夫しました。その結果、すい臓のない遺伝子を持ったホスト胚と健常なブタドナー胚のキメラ胚盤胞により、キメラ状態になった産仔が複数得られました。これらのキメラブタでは、ないはずのすい臓がドナーである健常ブタ（赤色蛍光たんぱく遺伝子を持つブタ、あるいは褐色の毛色を持つブタ）胚由来の細胞で完全に形成されていることが確認されました。胚盤胞補完によって得られたこのキメラブタは正常に成長し、すい臓機能や繁殖能力も正常であることが確認されました。
　これによって、マウスやラットなどの小型実験動物で開発された胚盤胞補完システムが、大型動物であるブタにも適用可能であることが証明されました。また、体細胞クローニング技術が臓器欠損個体の胚を大量に生産するためには非常に有用であることが示されまし
た。


＜今後の展開＞
　ブタで胚盤胞補完の原理が証明されたことは、次の研究の焦点である、すい臓欠損ブタ胚に対する異種間胚盤胞補完が可能であるかを試みることができます。今回得られたキメラブタは生殖年齢になれば自然交配が可能となります。これにより、これらの個体を用いて、すい臓を欠損する性質を持った受精卵を採取できることで、Pdx１−Hes１遺伝子を持つブタ胚に、ウシ、ヒツジ、サルなどの多能性幹細胞を注入した大動物における異種キメラの作製・臓器置換を試みることが可能になります。
　また、胚盤胞補完で得られたキメラブタの次世代の胎仔は、ヒトの臓器再生医療に向けた研究の１つとして役立つものと期待しています。それは、キメラブタから生まれたすい臓欠損ブタ胎仔の体内にヒト多能性幹細胞由来のすい臓を形成する実験です。現在の研究では、倫理上、ヒトの多能性幹細胞を注入したブタ胚をブタの子宮に移植して、胎仔期以後の発育を調べる研究を行うことができません。そこで、すい臓欠損ブタ胎仔の体内に、すい臓への分化を誘導したすい臓の前駆細胞を移植することによって、ヒトのすい臓を作り出す試みです。ブタ胎仔のすい臓欠損という特徴は、ヒト細胞からすい臓を作るための「あき空間（ニッチ）」として有利に働くことが期待されます。また、ブタ胎仔の免疫機構は妊娠中期以前には未発達なので、その時期にヒトの細胞を移植しても拒絶反応が起こりません。患者由来の多能性幹細胞や、そこから生体外で分化させた細胞や組織を大型動物の個体の中に適切なタイミングと場所に移植することで、自身の臓器を作ることも可能になるかもしれません。
　本研究成果から、胚盤胞補完法によって、ヒト臓器作製にチャレンジするための技術基盤が構築されました。しかしながら、現在の日本のガイドラインではヒト多能性幹細胞を注入した動物の胚を子宮に入れて発育させることが禁じられているため実験を進めることができません。今後、生命倫理や法律についての議論が進むことが期待されます。


　※以下の資料は添付の関連資料「参考資料」を参照
　・図１　研究内容全体を示す模式図
　・図２　野生型ブタとすい臓（膵臓）欠損を誘導したブタ胎仔の内臓所見
　・図３　キメラ・すい臓（膵臓）欠損・健常ブタの内臓所見・蛍光観察
　・用語解説
　・論文名