理化学研究所、マウス生殖細胞から特徴的なエピゲノム領域を発見

マウス生殖細胞から特徴的なエピゲノム領域を発見
−従来不可能だった１００個程度の細胞からのゲノム修飾解析技術を開発−


＜ポイント＞
　・超微量解析技術により生殖細胞に特有な低メチル化DNA領域を発見
　・生殖細胞に特有な遺伝子発現とエピゲノム関連の解析に有用なリソースを特定
　・細胞分化や発がんに関するエピゲノム研究を促進


＜要旨＞

　理化学研究所（理研、野依良治理事長）は、従来では不可能だった１００個程度の細胞からのDNAメチル化［１］解析を可能とする技術を開発しました。この技術を用いてマウス胎児などから得られる少数の細胞を解析したところ、生殖細胞特有な遺伝子の発現に関わる低メチル化DNA領域を発見しました。これは、理研バイオリソースセンター（小幡裕一センター長）疾患ゲノム動態解析技術開発チームの阿部訓也チームリーダー、池田理恵子テクニカルスタッフ（筑波大学大学院博士課程在籍）、志浦寛相基礎科学特別研究員らと、米国アルバートアインシュタイン大学との共同研究グループによる成果です。

　生物を構成する細胞は、次代に遺伝情報を伝える生殖細胞と体を構成する体細胞に大別され、それぞれで働く遺伝子も大きく異なります。一方、生殖細胞特有な遺伝子の一部が、がん化した体細胞（がん細胞）で発現することが知られていますが、なぜ生殖細胞とがん細胞で共通した遺伝子が発現するのかはいまだ不明です。

　染色体を構成するDNAやタンパク質はさまざまな修飾を受けており、それぞれの細胞に特有な遺伝子発現はこの修飾パターン（エピゲノム［２］）により起こります。遺伝子発現制御に重要なゲノム修飾の１つであるDNAメチル化の解析には従来大量の細胞が必要だったため、ごく少数しか得られないマウス胎児の生殖細胞などには適用できませんでした。

　共同研究グループは、従来法を見直しさまざまな改良を加えることで１００個程度のごく少数の細胞のDNAメチル化解析が可能な技術を開発しました。この技術を用いてマウス胎児などの生殖細胞を解析した結果、広範囲にわたって低メチル化状態にあるDNA領域を発見しました。この領域には、生殖細胞特有に発現する遺伝子が集中し、中には生殖細胞とがん細胞に共通して発現する「がん精巣抗原［３］」遺伝子群も含まれていました。これらの領域では、染色体を構成するタンパク質の修飾も特殊であり、極めて独特なエピゲノム状態にあることが分かりました。

　がん精巣抗原遺伝子を含む広い領域が低メチル化状態にある、という今回の発見を手がかりとして、細胞の分化や、発がんに関与するエピゲノム研究が進展し、診断や創薬につながることが期待できます。また、今回開発した超微量解析技術は、応用範囲が広く、例えばこれまで解析困難だったiPS細胞集団に不均一性をもたらすエピゲノム状態の解析などへ展開し、より高品質のiPS細胞作製などへ適用できるでしょう。

　本研究は、文部科学省特定領域研究「生殖系列の世代サイクルとエピゲノムネットワーク」などの支援を受け実施され、その成果は日本の科学雑誌『DNA　Research』オンライン版（７月１６日付け：日本時間７月１６日）に掲載されます。


＜背景＞

　生物を構成する細胞は、生殖細胞（精子、卵子など）と体細胞に大別されます。体細胞は身体を形づくるのに必要で個体一代限りの細胞ですが、生殖細胞は次代に遺伝情報を受け渡す重要な役割を持つ世代をつなぐ「不死」の細胞といえます（図１）。これらの細胞は異なる役割を持つため、そこで働く遺伝子も異なっており、生殖細胞だけで発現し機能する遺伝子が多数存在します。興味深いことに、例えば雄生殖細胞特有の遺伝子の一部は、正常な体細胞では発現しませんが、がん化した体細胞（がん細胞）で発現することがあります。これらの遺伝子は、「がん精巣抗原」遺伝子と呼ばれています。しかし、なぜ生殖細胞とがん細胞で共通して発現するのか、その意義やメカニズムは不明なままです。

　細胞では、DNAのメチル化や染色体を構成するタンパク質であるヒストンのメチル化（ヒストン修飾［４］）などさまざまな修飾が起きており、細胞ごとに固有の修飾パターンで、遺伝子の発現を制御しています。DNAメチル化は遺伝子発現に関わるため、その制御機構を理解する上で重要ですが、生殖細胞で起きるDNAメチル化についてはこれまであまり理解が進んでいませんでした。生体内で発生する生殖細胞の数が限られており、通常の手法では解析が困難なことや、生殖細胞と同様な性質を持つ適切なモデル細胞リソースが無いことなどがその理由に挙げられます。


＜研究手法と成果＞

　共同研究グループは、生殖細胞に特有な遺伝子発現の制御機構とDNA修飾の関連性を調べることや、生殖細胞の特徴を兼ね備えた細胞リソースを探索することを目的に、網羅的な遺伝子発現解析とDNAメチル化の解析をマウスを用いて行いました。

　マウスの生殖細胞は、受精後７．５日胚に初めて出現し、その後、体内を遊走して受精後１１．５日前後に将来の精巣や卵巣となる胎児期生殖巣にたどり着きます。この生殖巣内で配偶子形成が進み、雌雄それぞれの生殖細胞、すなわち卵子と精子が作られます（図２）。胎児内に存在する生殖細胞の数はごく限られており、７．５日胚では５０個程度、最も多い場合でも１つの胎児から得られる生殖細胞は数千個にすぎません。従来のDNAメチル化解析には十万〜百万個ほどの細胞が必要なため、マウス胎児の生殖細胞には適用できません。そこで、共同研究グループは、従来法を見直し、偏りの少ないDNA増幅法など実験条件の最適化や、染色体全域が解析可能なカスタムマイクロアレイの利用などの改良を加えることで、最少１００個程度の細胞から得られるDNA（総量が０．５ナノグラム以上）から染色体全体のDNAメチル化解析ができる技術を開発しました（図３）。

　これを用いてマウス胎児から得られる生殖細胞、胚や生殖細胞に由来するさまざまな幹細胞、および数種の体細胞についてDNAメチル化を解析したところ、雄の生殖細胞から低メチル化状態にあるDNA配列を発見しました。そのDNA配列が染色体上のどこに存在するかを調べたところ、性染色体のX染色体に多く見られ、かつ比較的広い領域（最大９Mb＝９００万塩基長）に固まって存在していることが分かりました（図４）。X染色体上では、同様の特徴を持つ領域が全部で１６カ所見つかり、これらを「Large　Hypomethylated　Domain（LoD）」と名付けました。一般に、マウスなど哺乳類のDNAはその大部分が高メチル化されており、その中に数Kb（数千塩基長）の小さな低メチル化領域「CpGアイランド」が点在することが知られていました。しかし、LoDのような広い領域にわたる低メチル化領域の発見は、今回が初めてです。

　興味深いことに、LoDには生殖細胞特有に発現する遺伝子が集中して存在し、その中には「がん精巣抗原」遺伝子も複数含まれていました。通常、DNAの高メチル化は遺伝子発現を抑制するので、LoD領域に見られるDNAの低メチル化がこの領域の遺伝子発現を促進するのに必要であることが示されました。さらに、LoDの特徴として、DNAの低メチル化以外にヒストン修飾も特殊で、他の領域では見られない独特なエピゲノム状態にあることが分りました。この独特なエピゲノム状態が生殖細胞やがん細胞に特有な遺伝子発現の基盤になっていることが示唆されました。

　次に研究グループは、LoD領域がマウスから作製した幹細胞株に存在するかどうかについて探索したところ、胚性幹細胞（ES細胞）、生殖細胞の元となる細胞から作製した胚性生殖細胞（EG細胞）にはLoDは存在しませんでした。しかし、京都大学大学院医学研究科の篠原隆司教授らが作製した生殖系列幹細胞（GS細胞）［５］は、雄マウスの生殖細胞と類似した遺伝子発現パターンを示し、LoDを含め、ゲノム全体で非常によく似たDNAメチル化パターンも示しました（図５）。したがって、GS細胞は、生殖細胞特有な遺伝子発現とエピゲノムの関連を解析するための非常に有用な細胞リソースであることが明らかとなりました。


＜今後の期待＞

　今回、１００個程度の細胞からでも解析可能な技術を開発し、生殖細胞に特有なDNA領域のLoDを発見しました。今後LoDは、生殖細胞とがん細胞に共通のエピゲノムの形成や、がん細胞においてなぜ生殖細胞特有の遺伝子が発現するのか―などの意義について調べる手がかりになるだけでなく、生殖細胞やがん細胞のエピゲノムマーカーとしても利用が可能です。これらの解析には、理研バイオリソースセンターから提供されるGS細胞や各種がん細胞などのバイオリソースが大きく貢献するものと思われます。

　今回開発した微量な試料でも解析可能なDNAメチル化解析技術は、これまで解析困難であった現象にも適用可能です。例えば、近年、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞の集団中には、分化状態の異なる細胞集団が混在することが示されていますが、こうした不均一性をもたらすエピゲノム状態の解析などへの展開が期待できます。


＜原論文情報＞

　・Rieko　Ikeda，　Hirosuke　Shiura，　Koji　Numata，　Michihiko　Sugimoto，　Masayo　Kondo，　Nathan　Mise，　Masako　Suzuki，　John　M．　Greally，　Kuniya　Abe．　"Large，　male　germ　cell−specific　hypomethylated　DNA　domains　with　unique　genomic　and　epigenomic　features　on　the　mouse　X　chromosome"．　DNA　Research，２０１３，doi：１０．１０９３／dnares／dst０３０


＜発表者＞

　独立行政法人理化学研究所
　バイオリソースセンター　疾患ゲノム動態解析技術開発チーム
　チームリーダー　阿部　訓也（あべ　くにや）


※補足説明・参考図は、添付の関連資料を参照