京大、ペルオキシソーム病の肢根型点状軟骨異形成症RCDP−１の分子機構を解明

ペルオキシソーム病RCDP−１の分子機構の解明



　加藤博章　薬学研究科教授（理化学研究所客員研究員兼務）、中津亨　同准教授、潘東青　同研究員（当時は同研究科大学院生）らの研究グループは、文部科学省の「ターゲットタンパク研究プログラム」の支援のもと、重篤なペルオキシソーム病である肢根型点状軟骨異形成症RCDP−１の分子機構を解明しました。ペルオキシソームはエネルギー産生のための長鎖脂肪酸の分解など、重要な働きを持つ細胞小器官であり、その形成異常は重篤なペルオキシソーム病を引き起します。RCDP−１型はペルオキシソームの構成蛋白質を認識するPex７という輸送蛋白質の機能異常が原因です。本研究ではX線結晶構造解析の手法を用いて、Pex７とその補助因子Pex２１が協同してペルオキシソーム構成蛋白質を認識する仕組みを明らかにしました。

　本研究成果は、６月３０日１３時（米国東海岸時間）に米国の科学雑誌「Nature　Structural＆Molecular　Biology」に掲載されました。


＜本研究成果のポイント＞
　・ペルオキシソーム蛋白質輸送因子と輸送配列の複合体の原子構造を世界で初めて決定しました。
　・ペルオキシソーム輸送配列PTS２の認識機構が判明しました。
　・肢根型点状軟骨異形成症１型（RCDP−１）の正確な診断、新たな治療法の開発に分子基盤を提供することができるようになりました。


＜研究成果の概要＞
　ヒトから酵母まで、真核生物の細胞は細胞小器官と呼ばれる袋構造によりさまざまな機能を分業できるようになっています。細胞小器官には遺伝情報を記録するDNAを格納する核や細胞内のエネルギーを生産するミトコンドリアなどが存在し、中でもペルオキシソームは長鎖脂肪酸を分解し、エネルギー生産に適した物質に変えるなどの働きを持ち、真核生物の生存に重要な細胞小器官です。

　ペルオキシソームの内部に化学反応を触媒する酵素を正しく取り込むために、ペルオキシソームの脂質膜上にカギ穴（錠前）付きのゲートが備わっています。ゲートを形作る２０数種類の蛋白質のうち、錠前を形成する蛋白質がヒトでは２種類（パン酵母では４種類）存在し、PTS１とPTS２の２種類の輸送配列（カギ）を認識します。これらの輸送配列を認識する蛋白質に異常が生じると、カギとカギ穴が合わなくなるため、酵素がペルオキシソームに入れなくなり、ペルオキシソーム病を引き起こします。

　PTS１を認識する蛋白質であるPex５に機能異常が生じると、Zellweger症候群を発症します。一方で、PTS２を認識する蛋白質であるPex７に機能異常が生じると、肢根型点状軟骨異形成症（RCDP）１型を発症します。Pex５によるPTS１の認識機構はすでに２０００年にX線結晶構造解析の手法により解明されていました。しかし、PTS２の認識機構については、機能的なPex７を大量に生産することが難しく、X線結晶構造解析を適応することができていませんでした。

　今回、本研究グループは機能的なPex７の大量生産系を確立し、初めてPTS２とそれを認識する蛋白質の複合体の結晶構造を決定することに成功しました。その結果、RCDP−１型の原因蛋白質であるPex７がどのようにPTS２を認識するのかを明らかにしました。


＜研究手法と成果＞
　Pex７によるPTS２の認識機構を解明するために、本研究グループはモデル動物としてペルオキシソーム研究が進んでいるパン酵母Saccharomyces　cerevisiaeを用いました。パン酵母のペルオキシソーム酵素の一つであるチオラーゼは機能的なPTS２配列を持っています。その配列はPex７ともう一つの蛋白質（Pex２１もしくはPex１８）によって認識されることが知られていました。ヒトでも二つの蛋白質（Pex７とPex５）がPTS２の認識に必要です。本研究グループは真核生物の蛋白質生産系であるメタノール資化性酵母Pichia　pastorisを用いて、パン酵母のPex７の大量生産系を開発しました。さらにPex２１のPTS２認識に重要な領域を大腸菌で生産する系を構築し、PTS２、Pex７、Pex２１の三者を混合して複合体を形成させ、結晶を作製しました。大型放射光施設（SPring−８）を利用してX線結晶構造解析を行い、１．８オングストロームの高分解能の結晶構造を決定することに成功しました（図１a）。この結果、PTS２の９アミノ酸の配列がPex７とPex２１によって形成されたポケットに相補的に結合し、認識されるメカニズムが明らかとなりました（図１b）。

　　※図１は添付の関連資料を参照

　PTS２とPex７−Pex２１複合体との結合はまさに「カギとカギ穴」の関係でした。PTS２はαへリックスの構造になることで、９アミノ酸の配列のうち１番目のアルギニン（R）と８番目のヒスチジン（H）の側鎖は同じ方向を向き、２番目のロイシン（L）、５番目のイソロイシン（I）、そして８番目のロイシン（L）の側鎖は同じ方向を向くことが判明しました（図２a）。これらのアミノ酸の側鎖はカギの凹凸を形成します。一方で、Pex７とPex２１はカギ穴の部分凸凹を形成します。PTS２のアルギニンとヒスチジンの側鎖が納まる親水性の溝はPex７によって形成され、PTS２の２番、５番、８番目のロイシンやイソロイシンの側鎖が位置する疎水性の溝はPex７とPex２１が上下から挟み込むようにして形作られます（図２b）。PTS２のアルギニンとヒスチジンは塩基性のアミノ酸でPex７上の溝にある酸性アミノ酸と静電的な相互作用をすることも判明しました。つまり、PTS２というのは凹凸の形だけで認識されるだけではなく、マグネットキーのように電気的な引き合う力や反発する力もその認識に関わっていました。

　　※図２は添付の関連資料を参照

　突然変異によりPex７の一つのアミノ酸が変化し、RCDP−１型を発症した患者の例が知られています。この変異の入ったアミノ酸はちょうどPTS２の側鎖を認識する溝のアミノ酸であることが分かりました。一方で、PTS２の認識に関わらないPex７のアミノ酸が突然変異しても、RCDP−１型になる可能性が低いと考えられます。今回、本研究グループが決定した結晶構造に基づくことで、より正しい診断ができると考えられます。また突然変異によりPex７とPTS２の親和性が低下したことが原因となるRCDP−１型の患者に対して、PTS２との親和性を高めることができるような低分子、いわゆるケミカルシャペロンを開発する原子レベルの分子構造基盤を提供することができるようになりました。


＜用語説明＞
　RCDP−１型：
　英語名はrhizomelic　chondrodysplasia　punctata　type　１、日本語名は肢根型点状軟骨異形成症１型。PTS２を認識する蛋白質Pex７の機能異常が原因で、細胞機能に必須な酵素をペルオキシソームに輸送できなくなることで発症します。患者は体内のフィタン酸の増加やプラスマローゲンの減少などの症状を示します。症状が重篤な場合は生後数年以内に亡くなることが多いのですが、Pex７の機能異常の程度が軽い場合は数十年生きられる場合もあります。