理化学研究所、遺伝子改変なしにクローンマウスの出生率を１０倍高める技術を開発

遺伝子改変なしにクローンマウスの出生率を１０倍高める技術を開発
−畜産、医療、製薬分野への本格導入に期待−


◇ポイント◇
　・Ｘ染色体を不活性化するＸｉｓｔ遺伝子の過剰発現をＲＮＡ干渉法によって抑制
　・ＲＮＡ干渉法の効果がクローンマウス出生後のさまざまな遺伝子発現までも改善
　・遺伝子改変を伴わないため体細胞クローン量産へ向け安全・簡便・高効率の実現に期待


　独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、塩基配列を変えることなく遺伝子発現を抑制するＲＮＡ干渉法（※１）により、体細胞クローンマウスの出生率を１０倍以上改善する技術の開発に成功しました。これは、理研バイオリソースセンター（小幡裕一センター長）遺伝工学基盤技術室の小倉淳郎室長（筑波大学大学院生命環境科学研究科教授、東京大学大学院医学系研究科教授兼任）、的場章悟基礎科学特別研究員、動物変異動態解析技術開発チーム（阿部訓也チームリーダー）、東京医科歯科大学難治疾患研究所、大阪大学大学院生命機能研究科、長浜バイオ大学バイオサイエンス学部らの共同研究グループによる研究成果です。

　体細胞核移植クローン技術は、核を除いた未受精卵子（除核卵子）へ体細胞核（ドナー核）を移植し、ドナー核と同じ遺伝情報を持つ個体を作出する唯一の発生工学技術です。同じ遺伝情報を持った「コピー」の動物を無限に生産できることから、１９９７年のクローン羊「ドリー」誕生以来、畜産分野をはじめ製薬や医学分野への応用が大いに期待されています。しかし、体細胞クローン動物の生産効率は著しく低く、移植した胚の数％以下しか産まれてこないのが現状です。

　２０１０年に研究グループは、マウス体細胞クローンの着床前胚（胚盤胞）（※２）ではＸ染色体（※３）上の多くの遺伝子群が発現低下しており、その原因がＸ染色体上の遺伝子の発現を抑制するＸｉｓｔ（エグジスト）遺伝子（※４）の過剰発現であることを突き止めていました。そこで今回、ＲＮＡ干渉法を用いて、クローン胚でのＸｉｓｔ遺伝子の発現の一時的な抑制を試みました。その結果、Ｘｉｓｔ遺伝子の発現を抑制したクローン胚の発生能力は劇的に改善し、通常の１０倍以上の効率（移植胚あたり１２〜２０％）でクローン産子を作出することに成功しました。

　ＲＮＡ干渉法は遺伝子改変を伴わず、マウス以外のほ乳動物胚にも容易に応用できるため、開発した技術は家畜や各実験動物にも幅広く応用可能です。長年にわたり期待されていた畜産、医療、製薬分野への体細胞クローン技術の本格的導入が実現することが期待できます。

　本研究成果は、米国科学アカデミー紀要『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ：ＰＮＡＳ』１１月７日の週にオンライン掲載されます。


１．背　景
　体細胞クローン技術は核移植技術の１つであり、同じ遺伝情報をもった「コピー」動物を無限に生産できることから、畜産分野をはじめ実験動物を利用する製薬や医療分野など幅広い応用が期待されています。しかし、１９９７年に世界初の成体由来体細胞クローン羊「ドリー」が誕生して１５年以上が経過しましたが、体細胞クローン動物の生産効率は著しく低く、移植した胚の数％程度しか産まれてこないのが現状です。

　これまでに研究グループでは、体細胞クローンの効率が低い理由を明らかにするため、マウスをモデルとしてさまざまなクローン胚特有の異常を探してきました。特に２０１０年には、網羅的な遺伝子発現解析の結果から、体細胞クローンの着床前胚（胚盤胞）では性染色体の１つであるＸ染色体上の遺伝子群の多くが発現低下を示していることを見いだし、その原因がＸ染色体上の遺伝子の発現を抑制するＸｉｓｔ遺伝子の過剰発現であることを突き止めていました。さらに、Ｘｉｓｔ遺伝子を欠失したノックアウトマウスを用いて、体細胞クローンの産子作出の効率を１０倍近く改善することに成功しました（２０１０年９月１７日プレス発表）。しかし、この方法は遺伝子の欠損という遺伝子改変を伴うため、マウス以外の動物では技術的・法律的な壁があり、より簡便で実用可能な方法の開発が望まれていました。


２．研究手法と結果
　ある特定の遺伝子の機能を抑える手法の１つに、遺伝子の欠損や挿入といった遺伝子改変を伴わず、一時的な発現抑制を引き起こすＲＮＡ干渉法という方法があります。研究グループは、この方法を利用してＸｉｓｔ遺伝子の過剰発現を改善できるという想定（図１）のもと、Ｘｉｓｔ遺伝子の転写産物であるＲＮＡに対して相補的なｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（※５）を設計し、これを核移植直後の状態である１細胞期の雄のクローン胚に注入しました。Ｘ染色体が２本存在する雌では正常なＸ染色体とＸｉｓｔ遺伝子が過剰発現するＸ染色体を識別することが難しいため、今回はＸ染色体を１本しか持たない雄のクローン胚を用いました。その結果、通常のクローン胚では着床前期を通して見られるＸｉｓｔ遺伝子の過剰発現を、桑実胚（※２）期までに限って一時的に抑制することに成功しました（図２）。このとき得られた桑実胚期クローン胚の遺伝子発現を網羅的に解析すると、Ｘ染色体上の遺伝子だけでなく、常染色体上の多くの遺伝子群もその発現が正常化していることが分かりました。

　次に、これらＸｉｓｔ遺伝子の発現を抑制したクローン胚の発生能を評価するため、このクローン胚をマウスの卵管へ移植して、着床後の胚発生を解析しました。着床直後にあたる胎齢５．５日目で胚を観察したところ、ｓｉＲＮＡを注入しない通常のクローン胚では多くの胚が発生異常を起こし、正常な形態の胚は１％程度しか得られませんでした。一方、ｓｉＲＮＡを注入してＸｉｓｔ遺伝子の発現を抑制したクローンでは、通常の１０倍以上の効率（移植胚あたり１６％）で正常な形態の胚が得られました。この胚発生能の改善効果はその後も続き、出生時でも通常に比べて１０倍以上の効率（移植胚あたり最高で２０％）でクローン産子が産まれました（図３）。

　さらに興味深いことに、この産まれた産子の肝臓での遺伝子発現を網羅的に解析したところ、通常のクローン産子に見られる遺伝子発現の乱れが大幅に改善しており、着床前期の一時的なＸｉｓｔ遺伝子発現抑制効果が出生後の遺伝子発現にまで影響していることが分かりました（図４）。


３．今後の期待
　体細胞クローン技術は、畜産分野をはじめ実験動物を使用する製薬や医学分野などへの応用が期待されています。今回の研究で用いたＲＮＡ干渉法は遺伝子改変を伴わず、卵子や胚に直接ｓｉＲＮＡを注入するという非常に簡便な技術であり、幅広い動物胚にそのまま応用可能な技術です。実際に、ウシやブタなどの体細胞クローン胚でもＸｉｓｔ遺伝子が過剰に発現することが知られており、ＲＮＡ干渉法によるＸｉｓｔ遺伝子の発現抑制はこれらの畜産動物を用いたクローン技術においても有用である可能性があります。今後、本研究の成果をもとに、生物製剤の産生や、食糧増産、絶滅危惧種の保存などさまざまな分野で体細胞クローン技術の実用化が進むことが期待できます。


＜原論文情報＞
著者名：Ｍａｔｏｂａ　Ｓ，Ｉｎｏｕｅ　Ｋ，Ｋｏｈｄａ　Ｋ，Ｓｕｇｉｍｉｏｔｏ　Ｍ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ　Ｅ，Ｏｇｏｎｕｋｉ　Ｎ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ，Ａｂｅ　Ｋ，Ｎａｋａｎｏ　Ｔ，Ｉｓｈｉｎｏ　Ｆ，ａｎｄ　Ｏｇｕｒａ　Ａ．
　“ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｏｆ　Ｘｉｓｔ　ｃａｎ　ｒｅｓｃｕｅ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｐｏｓｔｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１１，ｄｏｉ：１０．１０７３


＜　補足説明　＞

※１：ＲＮＡ干渉法
　特定の配列を持つ２本鎖ＲＮＡの導入によって、相補的なｍＲＮＡの分解を促進させること。結果的に、目的の遺伝子の機能を抑制することができる。

※２：着床前胚、胚盤胞、桑実胚
　哺乳類の卵子は、卵管で受精したのち子宮へ移動して着床する。その受精から着床までの間の受精卵を着床前胚と呼ぶ。マウスの場合、２、４、８細胞胚、桑実胚を経て、受精後３．５日目ごろ（着床直前）に胚盤胞となる。

※３：Ｘ染色体
　哺乳類の性染色体の１つ。性染色体の構成は、雄の細胞はＸＹ（Ｘ染色体とＹ染色体１本ずつ）、雌の細胞はＸＸ（Ｘ染色体が２本）となる。従って、通常はＸ染色体上の遺伝子の発現量を雌雄で均等化するために、雌の細胞ではＸ染色体の片方が不活性化されている。これをＸ染色体不活化と呼ぶ。

※４：Ｘｉｓｔ（エグジスト）遺伝子
　Ｘ染色体上の遺伝子の１つ。その転写産物であるＲＮＡが同Ｘ染色体を被覆し、クロマチン構造の抑制性変化が誘導される。最終的にＸ染色体上のほとんどの遺伝子発現が抑制されることにより、Ｘ染色体不活化が完成する。正常な着床前胚においては、雌雄胚とも母方（卵子）由来のＸ染色体からはＸｉｓｔ遺伝子は発現せず、不活化を免れている。しかしマウスの体細胞クローン胚では、雌雄に関わらず母方のＸ染色体からＸｉｓｔ遺伝子が異常に発現していた。

※５：ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
　ＲＮＡ干渉を引き起こす２１から２３塩基配列の短いＲＮＡ鎖。


　＊図１〜４は添付の関連資料を参照