理研、カラム分離なしで複雑な代謝混合物を構造解析し同定する方法を構築

カラム分離なしで複雑な代謝混合物を構造解析
−多次元NMR法の巧みなパルス操作と理論計算での構造確認−


■要旨
　理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター環境代謝分析研究チームの菊地淳チームリーダー、小松功典大学院生リサーチ・アソシエイトらの研究チーム（※）は、多次元核磁気共鳴（NMR）法［１］のパルス系列［２］を巧みに操作し、樹木（ツツジ）の二次代謝物［３］をカラム分離［４］することなく、抽出物のまま構造解析し、同定する方法を構築しました。

　ツツジ科植物は東アジアに広く分布しており、組織中に草食動物や病原体に対する防御物質（毒）として機能すると考えられている二次代謝物を持っています。しかし、その詳細な構造解析は進んでいませんでした。従来のカラム分離を使った代謝物の解析は、スペクトルが単純化し強力ですが、一試料あたりの計測時間が長くなり、異なるカラム間での計測データの再現性が悪いという問題がありました。そこで、研究チームはカラム分離を経ないNMR法に着目し、二次代謝物の詳細な構造解析法の構築に挑みました。まず、日本の山地植物を代表するレンゲツツジを芽生えのときから１３CO２安定同位体［５］存在下で生育させ、１３C（炭素）で標識化したレンゲツツジの抽出物試料（低分子混合物）を得ました。そして、多次元NMR法のパルス系列を巧みに操作し、抽出物試料の分子を構成する炭素骨格の間で磁化を移動させることによって、複雑な二次代謝物の炭素骨格構造の一次構造（生体分子の特定単位とそれらをつなぐ化学結合の配置）を解析・推定しました。続いて、量子化学計算［６］に基づく理論値とNMRスペクトルの実測値との比較から、推定構造を確認しました。その結果、世界最高となる炭素核で３８６、水素核で３８０のシグナル帰属数を達成し、世界中に公開されている代謝物のNMRスペクトルデータベース［７］にリスト化されていないテルペンやフラボノイドを含む８個の二次代謝物も新たにシグナル帰属できました。

　NMR法で得られる実験情報は物理量であるため、世界中のどのNMR装置で計測しても、同じ値（共鳴周波数）を再現できます。したがって、代謝物のNMRスペクトルデータベースの充実化は、代謝を対象とする世界中の研究者に貴重な情報を提供することになります。また本研究は、農林水産物の生産現場に安価で小型のNMR装置を配備し、カラム分離を必要としないその場での代謝物解析へつながると期待できます。

　本成果は、ドイツの科学技術雑誌『Angewandte　Chemie　International　Edition』に掲載されるのに先立ち、オンライン版（４月６日付け）に掲載されました。


※研究チーム
　理化学研究所　環境資源科学研究センター　環境代謝分析研究チーム
　チームリーダー　菊地　淳（きくち　じゅん）
　テクニカルスタッフ　篠　阿弥宇（しの　あみう）
　大学院生リサーチ・アソシエイト　小松　功典（こまつ　たかのり）
　研修生　大石　梨沙（おおいし　りさ）


■背景
　私たちが生物資源を利用する際は、目的の成分のみを分離して利用する場合と、分離せずそのまま利用する場合があります。例えば、ほとんどの食品は可食部をそのまま調理することで、複雑な混合物中のアミノ酸や糖類などから、豊かな味わいを楽しむことができます。一方、身体に有用な物質のみを分離して、サプリメントとして摂取することもできます。樹木や藻類のような植物系バイオマスも、高分子混合物のまま利用する場合と、セルロースや寒天といった目的の成分のみを分離して利用する場合があります。研究チームはこれまでに、さまざまな高分子の解析法を構築してきました。例えば、固体マジック角回転（MAS）法［８］や高分解能MAS（HR−MAS）法［８］を用いて、プランクトン（ミドリムシ）や褐藻（ヒジキ）といった未分離試料の高分子成分・運動性解析注１）や、多糖類のミネラル吸着を含めた超分子解析注２）に成功しています。また、陸上植物を対象とした高分子複合系解析では、異なる計測法を使ってセルロースとヘミセルロースを分離して検出することにも成功しました注３）。

　ツツジ科植物は東アジアに広く分布しており、その組織中に草食動物や病原体に対する防御物質（毒）として機能すると考えられている二次代謝物（低分子）を持っています。しかし、その詳細な構造解析は進んでいませんでした。従来のカラム分離を使った代謝物解析は、スペクトルが単純化し強力ですが、一試料あたりの計測時間が長くなり、異なるカラム間での計測データの再現性が悪いという問題がありました。そこで、研究チームはさまざまな物性を持つ多様な代謝物を一斉に解析するため、カラム分離しなくても成分解析ができる核磁気共鳴（NMR）法に着目し、「多次元NMR法」を導入することによって、ツツジ毒を含む低分子混合物のシグナル帰属と構造解析が可能かを検証することにしました（図１）。

　NMR法は静磁場に置かれた原子核の共鳴を観測し、分子の構造や運動状態などの性質を調べる分光方法です。多次元NMR法では、間接的に信号を検出してから核スピン（原子核が持つ全角運動量）間での磁化移動を行い、その後、信号を直接観測します。得られた多次元スペクトルは、核スピン間の相関マップ（隣接する核スピンの情報を網羅的に示したもの）となるため、代謝物の構造に関する情報が得られます。

　注１）２０１５年５月１５日プレスリリース「有用プランクトンを細胞丸ごと計測する多次元固体NMR解析」
　注２）２０１４年１月１４日プレスリリース「海藻類の有機・無機成分複雑系の統合解析技術を構築」
　注３）２０１３年９月２０日プレスリリース「多次元NMR法によるリグノセルロースの立体構造評価手法を構築」


■研究手法と成果
　研究チームは、計測温度、塩濃度、pH（酸性度）などの物理化学条件を一定とし、実験室にある精製試薬で可溶な代謝物のほとんどを２次元NMR計測することにより、代謝物によって異なるスペクトルのデータベースを整備してきました注４）。また、ここ数年、この分野で多く用いられる水溶液系データベースに加え、メタノール溶媒系データベースも整備してきました。今回は溶媒として、幅広い極性の二次代謝物が溶解しやすいメタノール抽出を用いることにしました。

　また、多次元NMR法で低分子混合物のシグナル帰属と構造解析を行うため、レンゲツツジに含まれる物質を一様に１３C（炭素）で標識することにしました。レンゲツツジを芽生えのときから、１３CO２安定同位体存在下で生育させ、光合成反応を利用することで、１３Cで標識することに成功しました。

　天然の１３C存在比は約１％（０．０１）ですが、１４週間の生育で、植物体全体で６０％、ツツジ毒を含む二次代謝物では７３％の１３C標識率を達成しました。１３Cで標識せずに解析する場合、複雑な二次代謝物の構造解析用に炭素骨格の１３C−１３Cの核スピン間を磁化移動［１］させようとすると、存在比０．０１×０．０１＝０．０００１、つまりわずか０．０１％の１３C核スピン対をNMR計測しなければならず、膨大な時間がかかります。一方、解析に用いた試料は、１３Cでの標識率が７３％（０．７３）のため、存在比０．７３×０．７３＝０．５３２９≒０．５３、つまり５３％の１３C核スピン対を計測すればよいことになります。これは、５，０００倍以上の効率化に相当し、比較的低濃度のメタノール抽出混合状態のまま、多次元NMR法の計測ができました。

　複雑な二次代謝物の構造解析を行うには、NMR法で３C−１３Cの核スピン間の磁化移動が天然存在比では困難な４級炭素（水素が隣接しない炭素）を含めた解析が鍵となります。そこで、従来の代謝物解析では用いられることが少ない３次元パルス系列を導入することで、４級炭素とそれ以外の官能基とをつなぎ合わせました（図２）。その結果、世界最高となる３８６炭素核、３８０水素核のシグナル帰属数を達成し、世界中に公開されている代謝物のNMRスペクトルデータベースにリスト化されていないテルペンやフラボノイドを含む８個の二次代謝物も新たにシグナル帰属できました。

　さらには、新たに推定した８個の二次代謝物およびさまざまな化学構造を持つ４３個の標準的な化合物に対して、計算機ソフトウエア上で立体構造モデルを組み上げ、これらの化合物座標を利用して量子化学計算を行いました。量子化学計算ではNMR計測で得られる化学シフト［９］などの物理情報を、理論値として予測できます。仮に、NMR計測で帰属した化学シフトと対応する代謝物構造が間違っていると、外れ値（データの全体的な傾向から大きくはずれた値）となります。そこで、最近では精製物の構造決定を行う天然物化学者でも、量子化学計算を構造確認に用いる報告が増えています。研究チームは、推定した二次代謝物と標準化合物における理論値と実測値の差の比較から、推定構造の妥当性を証明しました。

　生物の安定同位体標識実験は、構造解析の他にも代謝動態を追跡できるという長所があります。そこで研究チームは、レンゲツツジ生育の１４週目以降から１３Cでの標識を止めることで、光合成反応で取り込まれる炭素が１２Cに切り替わることを利用し、時系列でどの代謝物の１３C標識率が低下するか追跡しました。その結果、光合成反応から代謝経路の近い糖やアミノ酸といった一次代謝物は２週間ほどで急激に１３C標識率が低下しました。それに対して、ツツジ毒などの二次代謝物は１３C標識率低下には６〜１３週間も要することが分かりました。この結果は、生物の成長に関係する一次代謝は速く行われるのに対し、二次代謝は相対的に遅いということ示しています。１回の時系列サンプリングから、同時に多数の物質の代謝動態を追跡できることも、カラム分離を必要としない解析手法のメリットといえます。

　注４）２０１０年１月２８日プレスリリース「未利用のバイオ資源の有効活用に向け、代謝混合物の新たなNMR評価法を開発」


■今後の期待
　人類史をたどると、水陸の生物種から食料、木材、油などの有用物質が生産されてきました。こうした生物種からの有用物質の生産は持続的・循環的であることが望まれます。有用生物種の特性を速く解析するには、どの分子種を蓄積する能力を持つのかをプロファイル化する技術が必要です。カラム分離なしに混合物のまま解析する技術は、実験室のない食品工場や生産現場での品質評価も可能になります。

　一般に商業的価値が見出されていない未利用資源を迅速に解析する際に、データの再現性が極めて高く、試料の調製過程が簡単なNMR法には大きな可能性があります。例えば、MAS法であれば破砕や抽出といった工程を経ずに、どの分子種を蓄積する能力を持つのかを、プロファイル化することができます。特に最近では、永久磁石や電磁石が小型で安価なNMR装置を用いた簡易分析システムの研究が盛んに行われています。農林水産物のようなキロ単価の安価な生物材料に対しても、生産現場評価ができる時代が近づいています。


■原論文情報
　・Takanori　Komatsu，Risa　Ohishi，Amiu　Shino，Jun　Kikuchi，"Structure　and　metabolic　flow　analysis　of　molecular　complexity　in　１３C−labeled　tree　by　２D　and　３D−NMR"，Angewandte　Chemie　International　Edition，DOI：１０．１００２／anie．２０１６００３３４R１


■発表者
　理化学研究所
　環境資源科学研究センター（http://www.riken.jp/research/labs/csrs/）　環境代謝分析研究チーム（http://www.riken.jp/research/labs/csrs/env_metab/）
　チームリーダー　菊地　淳（きくち　じゅん）
　大学院生リサーチ・アソシエイト　小松　功典（こまつ　たかのり）


　＊補足説明・図１・２は添付の関連資料を参照