理研と東京医科歯科大、肝がん再発予防薬の作用メカニズムを解明

肝がん再発予防薬の作用メカニズムを解明
−非環式レチノイドはタンパク質架橋酵素の核移行を制御する−


■要旨
　理化学研究所（理研）ライフサイエンス技術基盤研究センター微量シグナル制御技術開発特別ユニットの小嶋聡一特別ユニットリーダー（東京医科歯科大学大学院教授）、ラジャン・シュレスタ国際プログラム・アソシエイト（研究当時）（東京医科歯科大学大学院博士課程）と、今本細胞核機能研究室の今本尚子主任研究員、東京医科歯科大学生体材料工学研究所の影近弘之教授らの共同研究グループ（※）は、肝がんの再発を予防する世界初の薬として期待され、治験［１］が進められている「非環式レチノイド［２］（一般名：ペレチノイン）」が、選択的に肝がん細胞の細胞死を引き起こす分子メカニズムを明らかにしました。

　肝がん（肝臓がん）は、外科的切除などで治療した後も再発する確率が高く、極めて予後不良の疾患です。肝がん細胞を選択的に死滅させる非環式レチノイドは再発リスクを２０％以下に抑える効果があり、肝がん再発予防薬として、現在、第III相臨床試験［１］が行われています。小嶋特別ユニットリーダーらは２０１１年、非環式レチノイドが肝がん細胞に特異的に作用し、通常は細胞質に存在するタンパク質架橋酵素「トランスグルタミナーゼ（TG２）［３］」の細胞核への局在を引き起こし、細胞核で働く転写因子Sp１［４］を過度に架橋することを発見しました。その結果、がん細胞の生存に必須な増殖因子受容体遺伝子の発現が抑制され、肝がん細胞が死滅することを報告しました。しかし、非環式レチノイドがどのようなメカニズムで、TG２の核局在を誘導するのかは不明でした。共同研究グループは、TG２を構成する４つのドメイン（領域）のうち、３番目のドメインに核内移行シグナル［５］、４番目のドメインに核外移行シグナル［５］が存在することを見出しました。さらに、非環式レチノイドはTG２に直接作用し、TG２と核内移行の運び屋タンパク質であるインポーチンとの複合体形成を約２倍に高めることで、がん細胞においてTG２の核局在を引き起こすことを発見しました。
　正常細胞においてTG２が細胞核に局在することは、肝障害や神経変性疾患などの病態増悪の原因になることが知られています。今回の発見は、TG２の核局在を標的としたこれら疾患の新しい薬剤開発につながる可能性があります。

　本研究は、日本学術振興会のCore−to−Coreプログラム「難治疾患に対する分子標的薬創製のための国際共同研究拠点の構築」（代表：東京医科歯科大学生体材料工学研究所　影近教授）および文部科学省科学研究費補助金の支援のもとに行われました。成果は、英国の科学雑誌『Cell　Death＆Disease』オンライン版（１２月３日付け）に掲載されました。

※共同研究グループ
　ライフサイエンス技術基盤研究センター　生命機能動的イメージング部門
　イメージング応用研究グループ　微量シグナル制御技術開発特別ユニット
　特別ユニットリーダー　小嶋　聡一（こじま　そういち）
　（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科理研生体分子制御学分野連携教授）
　国際プログラム・アソシエイト　ラジャン・シュレスタ（Rajan　Shrestha）
　（研究当時）（東京医科歯科大学大学院博士課程）
　国際プログラム・アソシエイト　ロナク・シュレスタ（Ronak　Shrestha）
　今本細胞核機能研究室
　主任研究員　今本　尚子（いまもと　なおこ）
　専任研究員　小瀬　真吾（こせ　しんご）

　東京医科歯科大学　生体材料工学研究所　薬化学分野
　教授　影近　弘之（かげちか　ひろゆき）


■背景
　日本の肝がん（肝臓がん）死亡者数は、２０００年代前半をピークに緩やかに減少しつつありますが、いまだ年間の死亡者数が３万人を超えています。また世界的には肝がんは、全がん種の中で死因の第２位です　注１）。肝がんは手術による外科的切除など初回の根治治療後も、二次性発がん［６］が年率（１年間の発がん率）約５％の割合で起こり、５年生存率は５４．２〜７１．１％と極めて予後不良の疾患です。非環式レチノイド（一般名：ペレチノイン）は、国内第II／III相臨床試験において、C型肝炎ウイルス陽性肝細胞がんの根治術後の再発リスクを２０％以下に減少させることが示されており　注２）、世界初の肝がん再発予防薬として現在、第III相臨床試験が行われています。

　これまでの研究によって、非環式レチノイドは正常肝細胞には影響を与えず、肝がん細胞やその芽となる肝がん前駆細胞を選択的に死滅させることが分かっています。小嶋聡一特別ユニットリーダーらは２０１１年、非環式レチノイドが肝がん細胞に特異的に作用し、通常は細胞質に存在するタンパク質架橋酵素「トランスグルタミナーゼ（TG２）」の細胞核への局在を引き起こし、細胞核で働く転写因子Sp１を過度に架橋することを発見しました。その結果、がん細胞の生存に必須な増殖因子受容体遺伝子の発現が抑制され、肝がん細胞が死滅することを報告しています　注３）。しかし、TG２がどのようなメカニズムで細胞核に局在し、非環式レチノイドがなぜその核局在を誘導できるのかは不明でした。

　注１）日本肝臓学会「肝がん白書　平成２７年版」（https://www.jsh.or.jp/files/uploads/Liver%20Cancer%202015.pdf）
　注２）Okita　K１，Izumi　N，Ikeda　K，Osaki　Y，Numata　K，Ikeda　M，Kokudo　N，Imanaka　K，Nishiguchi　S，Kondo　S，Nishigaki　Y，Shiomi　S，Ueshima　K，Isoda　N，Karino　Y，Kudo　M，Tanaka　K，Kaneko　S，Moriwaki　H，Makuuchi　M，Okusaka　T，Hayashi　N，Ohashi　Y，Kumada　H；Peretinoin　Study　Group．，Survey　of　survival　among　patients　with　hepatitis　C　virus−related　hepatocellular　carcinoma　treated　with　peretinoin，an　acyclic　retinoid，after　the　competion　of　a　randomized，placebo−controlled　trial．，J　Gastroenterol　２０１５　Jun；５０（６）：６６７−７４．doi：１０．１００７／s００５３５−０１４−０９９６−１
　注３）Tatsukawa　H，Sano　T，Fukaya　Y，Ishibashi　N，Watanabe　M，Okuno　M　et　al．Dual　induction　of　caspase　３−　and　transglutaminase−dependent　apoptosis　by　acyclic　retinoid　in　hepatocellular　carcinoma　cells．Mol　Cancer　２０１１　Jan　９；１０：４．　doi：１０．１１８６／１４７６−４５９８−１０−４．


■研究手法と成果
　TG２は６８７個のアミノ酸からなるタンパク質で、A、B、C、Dの４つのドメイン（領域）で構成されています（図１上）。共同研究グループはまず、どのドメインがTG２の核局在に必須であるかを調べるために、さまざまなドメインの組み合わせからなるTG２の変異タンパク質を遺伝子組換えにより作製しました。具体的には、TG２を構成する４つのドメインを１つずつ欠損させた変異遺伝子や、特定のドメインのみを発現する遺伝子を遺伝子工学的に作製しました。さらにこれらを、遺伝子組換えにより蛍光タンパク質（EGFP）の遺伝子と融合させることで、TG２の変異タンパク質の細胞内分布を蛍光顕微鏡で観察できるようにしました。

　次に、肝がん細胞にTG２変異タンパク質を強制発現させた後に、非環式レチノイドで処理を行い、蛍光顕微鏡下で経時的に観察して、TG２が細胞質に局在するのにどのドメインが大切なのかを定量的に観察しました。その結果、１９９９年にフランスの研究チームがコンピュータ解析で予測したBドメインの２５９番目のアスパラギン酸から始まる５アミノ酸や、Dドメインの５９７番目のプロリンから始まる６アミノ酸は核内移行シグナルとしては重要ではなく、新たにCドメインの４６６番目のアラニンから始まる１４アミノ酸（466AEKEETGMAMRIRV479）に核内移行シグナル（TG２　NLS）が存在することが分かりました。また、Dドメインの６５７番目から始まる８アミノ酸（657LHMGLHKL664）には核外移行シグナル（TG２　NES）が存在することから、これら２つのシグナルの働きにより、TG２が核と細胞質を行き来できることが示されました（図１下）。

　非環式レチノイドによるTG２の核局在は、肝がん細胞を非環式レチノイドで処理を始めてから４〜６時間後に起こり、TG２が核に局在した肝がん細胞は６〜１０時間後に死滅しました。一般的に、タンパク質が核内に移行する際にはインポーチンα／β［５］という運び屋タンパク質ファミリーと複合体を形成することが知られています。そこで、TG２とインポーチンとの結合を免疫沈降法［７］とPLA（Proximity　Ligation　Assay）法［８］で調べました。その結果、TG２がインポーチンα／βと複合体を形成し、非環式レチノイド処理をした肝がん細胞では、複合体の量が対照（エタノール処理）に比べて、約２倍に増えていることが分かりました（図２）。また、新たに同定したTG２の核内移行シグナルである１４アミノ酸がペプチドとして大量に存在すると、複合体の形成が阻害されました。これは、核内移行シグナルペプチドがTG２と競合的にインポーチンα／βと結合することを示しており、TG２とインポーチンα／βの相互作用は核内移行シグナルを介していることが確認できました。

　以上の結果により、非環式レチノイドは肝がん細胞内においてTG２に直接作用して、TG２と核内移行の運び屋であるインポーチンα／βとの複合体形成を促進し、肝がん細胞でのTG２の核局在を引き起こし、その結果として、転写因子Sp１の架橋不活性化を介するがん細胞死を引き起こすことを見出しました（図３）。


■今後の期待
　今回の成果は、TG２の核移行の制御が、抗がん剤の新たな標的となることを示唆します。TG２の核移行をより特異的に、より効率良く促進する作用を持つ分子の探索により、がん細胞を死滅させる抗がん剤の開発が期待できます。一方、正常な肝細胞では、過度のアルコール摂取や、メタボリック・シンドロームに起因する遊離脂肪酸の刺激によってTG２の核局在が起こり、正常肝細胞が死滅して肝障害が引き起こされることを、小嶋特別ユニットリーダーらが報告しています　注４）この場合は、逆にTG２の核移行を阻害する薬の開発により、肝障害を抑えることができるようになると考えられます。

　注４）２００９年５月１日プレスリリース「タンパク質の架橋反応が細胞死を招き、アルコール性肝障害に」（http://www.riken.jp/pr/press/2009/20090501_2/）


■原論文情報
　・R　Shrestha，H　Tatsukawa，R　Shrestha，N　Ishibashi，T　Matsuura，H　Kagechika，S　Kose，K　Hitomi，N　Imamoto　and　S　Kojima，“Molecular　mechanism　by　which　acyclic　retinoid　induces　nuclear　localization　of　transglutaminase　２　in　human　hepatocellular　carcinoma　cells．”Cell　Death＆Disease，doi：１０．１０３８／cddis．２０１５．３３９


■発表者
　理化学研究所
　ライフサイエンス技術基盤研究センター（http://www.riken.jp/research/labs/clst/）
　生命機能動的イメージング部門（http://www.riken.jp/research/labs/clst/biofunct_dyn_img/）
　イメージング応用研究グループ（http://www.riken.jp/research/labs/clst/biofunct_dyn_img/img_app/）
　微量シグナル制御技術開発特別ユニット（http://www.riken.jp/research/labs/clst/biofunct_dyn_img/img_app/microsignal_reg/）
　特別ユニットリーダー　小嶋　聡一（こじま　そういち）
　（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科理研生体分子制御学分野連携教授）
　国際プログラム・アソシエイト　ラジャン・シュレスタ（Rajan　Shrestha）
　（研究当時）（東京医科歯科大学大学院博士課程）

　主任研究員研究室（http://www.riken.jp/research/labs/chief/）
　今本細胞核機能研究室（http://www.riken.jp/research/labs/chief/cell_dyn/）
　主任研究員　今本　尚子（いまもと　なおこ）

　東京医科歯科大学　生体材料工学研究所　薬化学分野
　教授　影近弘之（かげちか　ひろゆき）


　＊補足説明・図１〜３は添付の関連資料を参照