明大と自治医大など、効率的な方法で短期間に免疫のないブタを作ることに成功

効率的な方法で、短期間に免疫のないブタを作ることに成功


＜ポイント＞
　・医学研究用ブタの作出は非常に煩雑で多くの時間がかかっていた。
　・人工酵素と体細胞核移植を組み合わせた効率的な方法で、免疫不全ブタを作ることに成功。
　・免疫のないブタは、ヒトの重症複合型免疫不全症（SCID）（注１）の疾患モデルや、新しい幹細胞治療法やがん治療法の評価・開発などへの貢献が大きく期待される。


　JST課題達成型基礎研究の一環として、明治大学の渡邊將人（まさひと）特任講師と長嶋比呂志教授、自治医科大学花園豊教授らは、人工酵素と体細胞核移植を組み合わせた効率的な方法により、短期間（６か月）で免疫のない（免疫不全）ブタの作出に成功しました。
　ブタで特定の遺伝子機能を消失させる（ノックアウト（注２））には、外来遺伝子の導入を伴う相同組み換え（注３）が利用されていました。しかし、この方法は手順が非常に煩雑で、目的の遺伝子で組み換えが起こる効率の低さから多くの時間を要し、またゲノムに外来遺伝子を挿入する時に、目的以外の遺伝子機能を傷つけてしまうリスクを抱えています。今後、免疫不全症などの難治性疾患や再生医療の研究に遺伝子ノックアウトブタを用いるためには、より効率的に短期間で、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクのない方法が望まれていました。
　ジンクフィンガーヌクレアーゼ（注４）は最近発明された人工酵素で、全く新しい遺伝子編集ツールです。本研究グループは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現にDNAではなくmRNAを用い、さらに体細胞核移植技術（注５）を組み合わせることにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクなく、短期間に免疫不全ブタを作ることに成功しました。
　この新手法により、今後ヒトの疾患を模倣した医学研究用ブタの作出を大きく加速できます。作製された免疫不全ブタは、ヒトSCID様の病態を示したことから、ヒト免疫不全症の忠実な疾患モデルとして、その治療法の研究に大きく貢献することが期待されます。また、ヒトの幹細胞やがんなどの各種評価は免疫のないマウスを用いて行われていましたが、今後はブタで可能になり、ヒトをより忠実に反映する知見が得られ、新しい幹細胞治療法やがん治療法の評価・開発につながることが期待されます。
　本研究成果は、２０１３年１０月９日（米国東部時間）発行の科学誌「PLOS　ONE」に掲載されます。

　本成果は、以下の事業・研究領域課題によって得られました。
　　戦略的創造研究推進事業チーム型研究（CREST）
　　　研究領域：「人工多能性幹細胞（iPS細胞）作製・制御等の医療基盤技術」
　　　　　　　　（研究総括：須田年生慶應義塾大学医学部教授）
　　　研究課題名：「ヒトiPS細胞の高品質化とその検証・応用」
　　　研究代表者：花園豊（自治医科大学分子病態治療研究センター教授）
　　　研究期間：平成２２年１０月〜平成２８年３月
　JSTはこの領域で、iPS細胞を基軸とした細胞リプログラミング技術の高度化・簡便化をはじめとした研究によって、革新的医療に資する基盤技術の構築を目指している。上記研究課題では、ヒトやサルやブタのiPS細胞をより初期状態へと誘導し高品質化を図るとともに、その発生工学的応用および臨床応用を目指している。


＜研究の背景と経緯＞
　ブタは解剖学的、生理学的、血液学的にヒトへの類似性が高いことから、ヒトに近い知見を得られる実験動物として利用され、実際に糖尿病やアルツハイマーなどヒトの病気を再現する病態モデルブタが作出されています。また、ヒト−ブタ間における異種移植において、臓器ドナーとして遺伝子改変ブタを利用する研究も進められています。このように利用されているブタにおいて、遺伝子改変技術の開発は非常に重要です。特定の遺伝子機能を消失させる遺伝子ノックアウト技術は、ヒトの病気を模倣した病態モデルブタの開発に極めて有用で重要です。
　遺伝子ノックアウトマウスの作製では、受精卵より作出された非常に未分化で増殖性の高い胚性幹細胞（ES細胞）を利用した相同組み換えを行い、この組み換えES細胞を初期胚に導入することでノックアウト個体の作出が行われています。しかし、ES細胞はマウスにほぼ限定的であり、ES細胞が樹立されていないブタでは、体細胞を用いて相同組み換えにより遺伝子ノックアウト細胞を取得し、これを核ドナー細胞として体細胞核移植によってノックアウト個体を作出する必要がありました。しかし、体細胞では相同組み換えが非常に低頻度でしか起こらないため、実際に個体を得るまでには多くの時間を要し、この非効率性と煩雑さが遺伝子ノックアウトブタ作出の大きな障害となっていました。
　ジンクフィンガーヌクレアーゼの登場により、効率的に遺伝子改変が可能となり、研究チームはジンクフィンガーヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトがブタ初代培養細胞において可能なことを世界で初めて示しました。その後、いくつかの遺伝子ノックアウトブタが作出されていますが、これらのノックアウトブタの作出では、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現にプラスミドDNAが利用されています。プラスミドDNAを用いた方法は、動物個体のゲノムに外来遺伝子が挿入される懸念があり、このことは動物が持つ本来の遺伝子を破壊してしまうリスクを含んでいることを意味します。そこで、研究グループは、mRNAが通常ではゲノムへ組み込まれないことを利用し、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAと体細胞核移植技術と組み合わせることにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクのない安全なノックアウトブタの作出を試みました。
　免疫機能のない（免疫不全）動物は拒絶反応を起こさないため、同種のみならず、異種動物の細胞・組織の移植が可能です。このため、がん研究、ヒトiPS細胞などの幹細胞移植研究、創薬研究など、さまざまな研究に非常に有用であることから、新手法を用いて免疫不全ブタ（SCIDブタ）の作出に取り組みました。


＜研究の内容＞
　ヒトSCIDの多くは、インターロイキン２受容体γ鎖（IL２RG）遺伝子の変異により起こることが知られ、実際にIL２RGをノックアウトしたマウス、ラット、ブタはヒトと同様の症状が現れることが知られています。従って、免疫不全ブタを作出するにあたり、IL２RG遺伝子をノックアウトすることに決めました。DNAと異なりmRNAが通常ゲノムへ組み込まれないことを利用して（図１）、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAを合成し、これを体細胞である皮膚由来線維芽細胞へ導入しました。これにより、一時的にジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させ、遺伝子挿入を起こさせずに目的の遺伝子に変異を誘導し、体細胞核移植に使用するIL２RG遺伝子の機能を消去したノックアウト細胞（核ドナー細胞）を得ました。一般に、体細胞を用いた相同組み換えの頻度は非常に低く（１００万個から１億個の細胞あたり１回程度）、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した本研究ではその１万倍以上の効率で変異を導入することができました（図２）。さらに、通常１２ヵ月は要する時間を約６ヵ月へと短縮し、IL２RGノックアウト個体を得ることができました。
　作出されたIL２RGノックアウトブタは、IL２RGの発現が完全に欠損し、免疫に必須な器官として知られる胸腺を欠失していました。また、免疫細胞であるリンパ球（T細胞、NK細胞）を欠損している（図３）ことが明らかとなり、作出したブタはヒトSCIDと同様の症状が現れることを確認しました。
　今回、作出したSCIDブタは、通常の飼育環境では免疫不全により死んでしまうため、分娩を行いませんでしたが、すでに樹立している核ドナー細胞から体細胞核移植を行うことにより、同じSCIDブタの再作出が可能です。


＜今後の展開＞
　本研究で作出されたIL２RGノックアウトブタは、ヒトの重症複合型免疫不全症（SCID）と同様の症状が現れたことから、よりヒトの病態を忠実に再現するSCIDモデル動物として、SCID患者由来iPS細胞を用いた幹細胞移植治療法の検討などSCID患者の治療法の確立に大きく貢献します。
　また、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAの利用と体細胞核移植技術を組み合わせにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクなく、短期間で効率的に遺伝子ノックアウトブタを作出することが可能となったことは、今後さまざまな遺伝子に対するノックアウトブタ作出への利用が大きく見込まれます。これにより疾患モデルブタや異種移植ドナーブタなどを用い、ヒトiPS細胞の機能・安全性評価、ヒト組織・臓器の再生、がんなどのさまざまな医学研究に利用されるブタの開発が大きく加速し、げっ歯類モデルなどの小動物だけでは得られない、よりヒトに近い知見を得られることが期待されます。
　今後は、本研究で作出したIL２RGノックアウトブタをベースとして、免疫に関与する遺伝子のさらなるノックアウトを試み、より重篤な免疫不全ブタの開発を目指し、再生医学研究の発展に貢献することが期待されます。


　※参考図・用語解説は、添付の関連資料を参照


＜論文タイトル＞
　"Generation　of　Interleukin−２　Receptor　Gamma　Gene　Knockout　Pigs　from　Somatic　Cells　Genetically　Modified　by　Zinc　Finger　Nuclease−Encoding　mRNA"
　（ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAを用いた免疫不全ブタの作出）